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  • 蛋白质样品的制备

      
    目前,疫霉菌的分类鉴定仍以形态特征为主要依据。但是,由于疫霉菌形态变异较大,一些分类依据不稳定,因而有时依据形态难以鉴定。已经证明,同种疫霉菌菌株间的菌体可溶性蛋白质电泳图谱相似,主要蛋白带型相同。应用这一技术,已成功地确定了一些依据形态特征难以鉴定的疫霉菌株的分类地位。
    一、蛋白质样品的制备
    将新鲜培养的菌丝块(大小约2× 2mm)数块接种于盛有适合疫霉菌生长的培养液的平底烧瓶中(每个250ml容量的平底烧瓶装150ml培养液)。在适温、黑暗条件下静置培养7天左右,用干净纱布滤出菌丝体。将菌丝丛中的培养基小块去掉,菌丝体用25%乙醇冲洗,再用蒸馏水反复冲洗3~4次,在双层纱布中挤去多余的水份。收集冲洗后的菌丝并称湿重。按1:1(W/V)加入pH6的磷酸缓冲液(0.2M Na2HP04 123ml与0.2M NaH2PO4 877ml混合配制),冰冻过夜。将冰冻后的菌丝体置于研钵中,加入少量石英砂,在冰浴下充分研磨成糊状。研磨后的菌丝液在18000转/分、4°C下离心1小时,倾出上清液。在上清液中加入10~15%的甘油或蔗糖(以防止加样后样品在电极缓冲液中漂浮),即为菌体可溶性蛋白质电泳样品。
    确定电泳样品中蛋白质含量:将标准酪蛋白溶解在pH6的磷酸缓冲液中,配成系列浓度。用紫外分光光度计在280nm波长下测定各浓度的OD值,画出标准曲线。在相同光波长下测定电泳样品的OD值,根据该OD值从标准曲线上查找出电泳样品的蛋白质含量。

    发布时间: 2009-05-11 19:18 浏览次数:   【 打 印 】【 关 闭
     
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