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  • 方法

      
    1.卵孢子萌发前的预处理 将培养基内含有大量卵孢子的培养皿用双层透明胶带封闭。培养皿置适温下、黑暗中保存。预处理的目的是使卵孢子完成生理后熟过程,进入可萌发状态。预处理温度因不同的疫霉种而有一定差异,一般而言,可选择菌丝最适生长温度作为卵孢子预处理的温度。
    2.卵孢子悬浮液的制各 卵孢子经一定时期的保存后,切取含有卵孢子的培养基一块(大小可视卵孢子含量及实验要求而定),加水50ml,用匀浆机在5000转/分下匀浆2分钟左右,以破碎培养基并使卵孢子与洋菜和菌丝脱离开。匀浆液经孔径76、54和25um(分别为200、300和600目)筛网过滤,用1000ml水反复冲洗200、和300目的筛网,再用500ml灭菌蒸馏水冲洗600目筛网。用少量灭菌蒸馏水洗下600目筛网上收集到的卵孢子,制备成卵孢子悬浮液。
    3.卵孢子处理 常用的卵孢子处理剂有KMnO4和H2O2,处理的目的是刺激卵孢子萌发,同时杀死卵孢子悬浮液中的菌丝片段、菌丝膨大体、孢子囊及厚垣孢子。
    (1)用KMnO1处理卵孢子 取新配的KMnO4母液1ml与9ml卵孢子悬浮液混合,置于摇床上(50转/分)处理20分钟,经600目筛网过滤。用1000ml蒸馏水冲洗筛网,再用300ml灭菌蒸馏水冲洗。用10ml灭菌蒸馏水洗下600目筛网上滤得的卵孢子。
    较理想的KMnO4处理浓度为0.1%~0.25%,最适合的KMnO4处理浓度因不同疫霉菌而有一定差异。处理前,可将KMnO4配成l%~2.5%的母液。新配制的KMnO4处理效果较好。
    (2)用H2O2处理卵孢子取1m13%医用双氧水与9ml卵孢子悬浮液混合,处理时间为2分钟。当H2O2加入卵孢子悬浮液中后,用玻棒迅速混匀,处理过程中不断缓慢地搅拌。随后的过滤与卵孢子收集与处理KMnO4的方法相同
    KMnO4和H2O2处理对刺激不同疫霉种的卵孢子萌发的效果有一定差异。例如,KMnO4处理对刺激烟草疫霉(寄生疫霉)、致病疫霉、芒麻疫霉、恶疫霉的卵孢子萌发效果很好,萌发率可达70%-90%。而H2O2处理对刺激掘氏疫霉的卵孢子萌发优于KMnO4对苎麻疫霉效果也很好,同时处理卵孢子后,H2O2易冲洗掉,残留少,副作用小。
    4.诱导萌发 用微量加样器吸取100ul处理过的卵孢子悬浮液于凹玻片中计数,调整卵孢子浓度使之每100ul悬浮液约含卵孢子20.0个左右。在S+I培养基平板上加入卵孢子悬浮液,每皿(直径9cm)约含卵孢子20.0~600个,涂布均匀。为防止杂菌污染,在100ml的S+L培养基中加入青霉素、利福平、五氯硝基苯各5mg。培养皿用双层透明胶带封闭以保持皿内湿度,置光照条件下适温培养,7~10天后在显微镜下计算卵孢子萌发率。
    5.卵孢子萌发率计算 将培养皿打开,置于100倍显微镜下直接计数。随机移动培养皿,记录萌发与未萌发卵孢子的个数,每样本至少观察20.0个卵孢子,求出卵孢子萌发率。观察卵孢子的萌发和计数通常在将卵孢子涂布于S+L培养基上7天左右进行。以后每2天左右观察记录1次,直至卵孢子萌发率不再上升为止。在计数时,应注意仅记录健康的卵孢子,不要把已败育的卵孢子计算进去。因为败育的卵孢子不可能萌发,若一起统计进去,计算出来的卵孢子萌发率将偏低。败育的卵孢子表现为卵孢子内没有原生质、卵孢子发育不健全或藏卵器内没有卵孢子。在显微镜下,在S+L培养基平板表面上的健康与败育卵孢子不易区别,可采用以下方法矫正萌发率:在卵孢子悬浮液涂布之前,取50ul卵孢子悬液于凹玻片上,计算卵孢子的总数和败育卵孢子数,共取样5次,求出败育率。在S+L培养基上观察卵孢子萌发和计数时,记录所有观察到的卵孢子。卵孢子萌发率按以下公式计算:
            卵孢子萌发率     =      萌发卵孢子数             ×         100%
                           卵孢子总数 × (1-卵孢子败育率)

    发布时间: 2009-05-11 19:15 浏览次数:   【 打 印 】【 关 闭
     
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