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  • 常用培养基

      
    采用合适的培养基对成功分离和正确鉴定疫霉菌十分重要。许多疫霉菌的生长和产孢对培养基成份有特定的要求,例如一些疫霉菌在用于真菌分离和培养的常规马铃薯葡萄糖洋菜培养基上生长差,而许多疫霉菌产生孢子囊和卵孢子需要用V8或V6培养基。绝大多数疫霉菌可以在人工培养基上培养,而有少数疫霉菌如莎草疫霉(P.cyperi)、蒲草疫霉(P.lepironiae)和疣孢疫霉(P.verrucosa)等不能在人工培养基上培养,只能在活的植物组织上繁殖。一些在国外普遍使用的培养基,如V8培养基,由于在国内不易买到V8汁而难以广泛使用。本节结合我国的实际情况,介绍疫霉菌分离、培养、产孢常用的培养基配方、配制方法及主要用途。
    一、利马豆培养基
    利马豆粉60g 洋菜20g 水1000ml。
    利马豆粉60g加水1000ml,在60°C下水浴1小时,双层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000ml,加入洋菜20g,煮沸后持续沸腾数分钟,121°C高压蒸汽灭菌15~20分钟。
    利马豆培养基适用于大多数疫霉菌的分离、培养、繁殖和保存,但不适用于培养马铃薯晚疫病菌。利马豆俗称洋扁豆,在江苏南通及苏北等地有种植。利马豆培养基在加热过程中会产生大量气体,因此在灭菌前应充分煮沸,高压蒸汽灭菌结束后不要打开灭菌锅的放汽阀排汽,而是让其自然冷却减压,以防培养基冲开棉花塞。
    二、Ⅴ8培养基
    美国Campbell公司生产的,以8种蔬菜为主要成分混合制成的罐装V8汁作为主要原料,配制而成的培养基。因不同的实验要求,采用不同的配比,可配制成以下几种培养基:
    (一)10% V8培养基 10ml V8汁加去离子水90ml,CaCO30.02g,洋菜2g。
    适用于疫霉菌分离、培养、保存、诱导孢子囊产生、交配型测定和产生卵孢子。
    (二)5% V8培养基 5ml V8汁加去离子水90ml,CaCO30.02g,洋菜2g。
    适用于疫霉菌分离、培养和保存。
    (三)10%V8培养液 100ml V8 汁加入COCO31g,在1500转/分下离心10分钟。上清液与去离子水按1:9比例稀释。
    主要用于诱导产生孢子囊。
    (四)0.2% V8培养基 取经离心的V8汁上清液0.2ml,加入去离子水100ml 洋菜粉2g。
    用于游动孢子萌发和单游动孢子分离。疫霉菌游动孢子在这种培养基上的萌发率比在水洋菜培养基上的要高,且萌发后生长较好。为方便游动孢子萌发的观察和进行单孢分离,这种培养基要求使用质量较高的水洋菜粉。
    上述培养基均采用121°C高压蒸汽灭菌15~20分钟。
    三、V6培养基
    是以北京农业大学生产的,以6种蔬菜混合制成的V6汁(商品名为维乐菜)为主要原料配制雨成的培养基。经比较,该培养基具有与V8培养基相似的效用,为V8汁的理想替代品。用国产V6汁代替美国产的V8汁,按与V8培养基相同的4种配方,可配制10%、5%、0.2%的V6培养基和I0%V6培养液,并各具有相同的用途。
    四、胡萝卜培养基
    200g新鲜胡萝卜切成小片,加去离子水500ml,用组织捣碎机捣碎约40秒,用4层纱布过滤去渣,补足水至1000ml,加入洋菜90g,在121° C下高压蒸汽灭菌15~20 分钟。适用于多种疫霉菌的分离、培养和产生卵孢子。
    五、燕麦培养基
    燕麦片30g,加水1000m1在60°C下水浴1小时,双层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000ml,加入洋菜20g,煮沸待琼脂熔化后分装。121°C下高压蒸汽灭菌15~20分钟。
    适用于多种疫霉菌的分离、培养和诱导产生卵孢子。
    六、玉米粉培养基
    玉米粉30g,水1000ml,洋菜20g。配制方法及用途与燕麦培养基相同。
    七、番茄培养基
    番茄汁20ml,CaCO30.4g,洋菜2g,去离子水80ml。
    番茄汁的制备方法是,取新鲜成熟番茄果实,用自来水洗净后切成片,置于组织捣碎机中匀浆2分钟,经双层纱布过滤去种子和组织残余,滤过液即为所制各的番茄汁培养基在121°C下高压蒸汽灭菌20分钟。适用于多种疫霉菌的培养和产孢。
    八、大豆培养基
    大豆汁10ml,洋菜2g,去离子水90ml。
    大豆汁的制各方法是:60g干大豆种子用水洗净,浸泡过夜。浸泡过的大豆与330ml去离子水混合,用组织捣碎机破碎2分钟,经单层纱布过滤去渣。滤过液即为所制各的大豆汁。
    培养基在121°C下高压蒸汽灭菌20分钟。适用于多种疫霉菌的分离、培养与产孢。
    九、黑麦培养基
    黑麦50g,洋菜20g,去离子水1000ml。
    50g黑麦种子在1000ml去离子水中浸泡24~36小时,在121°C下高压蒸汽灭菌30分钟,经4层纱布过滤去渣。上清液补足水至1000ml,加入洋菜20g。在120°C下高压蒸汽灭菌。
    黑麦培养基特别适用于马铃薯晚疫病菌(P.infetans)的分离、培养与产孢。
    十、色氨酸培养基
    β-谷甾醇30g,L-色氨酸20mg,CaCl2100mg,维生素B11mg,10%V8培养基1000ml。
    将β-谷甾醇先溶于少量二氯甲烷(CH2Cl2)中,后加入10%V8培养基中,在121°C高压蒸汽中灭菌15分钟。L-色氨酸和维生素B1混合溶于少量水中单独灭菌,在使用前待培养基温度下降至50°C左右时加入,摇匀。
    该培养基主要用于交配型测定和诱导产生卵孢子。一些在10%V8培养基上配对不产卵孢子或卵孢子产生量少的疫霉菌株,在这种培养基上可产生较多的卵孢子。
    十一、sLA培养基
    β-谷甾醇2mg,卵磷脂50mg,CaC030.02g,天冬氨酸1mg,V6汁10ml,洋菜2g,去离子水90ml。
    将卵磷脂置于50ml水中,用匀浆机(5000转/分)匀浆3分钟,把卵磷脂充分打散,加入V6汁,CaCO3,洋菜2g,补足水至100ml。将β-谷甾醇用少量(数毫升)二氯甲烷溶解后与培养基混合。天冬氨酸用少量的水溶解后单独分装于小三角瓶内。上述制备物在121°C下灭菌20分钟。待培养基温度下降至50C左右时,将天冬氨酸溶液加入培养基中,摇匀。
    该培养基可极显著地提高疫霉菌卵孢子的产生量。尤其是对那些卵孢子产生量较少的同宗配台疫霉野生型菌株和人工诱变突变株,效果十分显著。
    十二、s+L培养基
    基础培养液1ml,卵磷脂10mg,葡萄糖4mg,洋菜2g,蒸馏水100ml,pH7.0。
    卵磷脂加蒸馏水100ml,用匀浆机(5000转/分)匀浆2分钟,将卵磷脂充分打散。加入基础培养液、葡萄糖,用lN KOH调至pH7.0,加入洋菜粉,121°C下高压蒸汽灭菌20分钟。
    用于诱导疫霉菌卵孢子萌发。
    基础培养液成分:
    (NH4)2SO4100mg,MgSO4·7H20 100mg,CaC12·2H2O 30mg,znSO4· 7H20 3mg,
    KH2P04 30mg,K2HPO460mg,蒸馏水100ml。
    十三、选择性培养基
    系在适合于疫霉菌生长的培养基中加入少量可以抑制其他真菌和细菌生长,而对疫霉菌生长抑制不大的抗生素和杀菌剂配制而成的培养基,主要用于疫霉菌的分离和纯化。在疫霉菌的选择性培养基中,常用于抑制细菌生长的抗生素有:青霉素、利福霉素、链霉素、氯霉素、万古霉素和多粘霉素等;用于抑制其他真菌生长的有:五氯硝基苯、苯莱特、恶霉灵、制霉菌素、匹马霉素、多菌灵等。
    选择性培养基的配制是在待培养基温度下降至50~60°C时,加入选用的药物,摇匀,即可倒平板使用。抗生素和杀菌剂可以配制成母液在4°C冰箱中保存。
    以下推荐5个较为成功的选择性培养基的药物配方,各配方均按100ml培养基所需的加药量计算:
    1.青霉素5mg,利福霉素(利福平)10mg,五氯硝基苯(PCNB)5mg。
    本配方中的利福霉素可选用医用利福平药片或胶囊。将药粉溶于95%乙醇中,缓慢滴加1N NaOH并搅拌,至药粉溶解,配制成母液。
    2.氨卞青霉素10mg,制霉菌素5mg,五氯硝基苯1mg。
    3.多粘霉素5mg,青霉素5mg,苯莱特5mg。
    4.氨卞青霉素10mg,利福平1mg,苯莱特1mg,制霉菌素2.5mg,五氯硝基苯2.5mg,恶霉灵4mg。
    5.青霉素5mg,链霉素3mg,五氯硝基苯5mg。
    对上述各配方,在缺乏五氯硝基苯时可用相同药量的多菌灵或苯莱特代替。

    发布时间: 2009-05-11 19:00 浏览次数:   【 打 印 】【 关 闭
     
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